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共振瑞利散射光谱在食管癌肿瘤标志物及肿瘤细胞检测中的应用研究

 
【摘要】:据国家癌症中心的统计,中国目前是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家,山西、河南、河北等省的太行山脉一带是我国食管癌的高发地区,其中90%以上的病例属于食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。及早发现并治疗是降低食管癌死亡率的有效途径,因此食管癌的早期诊断具有重要意义。传统的消化道内镜检查及病理学检查在发现早期食管癌方面效果欠佳,促使基于肿瘤标志物和肿瘤细胞的癌症早期筛查技术开发成为近年来的研究热点。功能化金纳米粒子生物传感器的研究为癌症的诊断和治疗提供了新的机遇。由于在生物大分子识别与检测方面的优良特性,共振瑞利散射(Resonance Rayleigh scattering,RRS)技术结合功能化金纳米探针,在肿瘤标志物和肿瘤细胞检测方面表现出良好的应用前景。本文以ESCC肿瘤标志物表皮生长因子受体:Epidermal growth factor receptor(简称EGFR)和Human epidermal growth factor receptor 2(简称HER2)为靶标,用对应的抗体及核酸适配体修饰金纳米粒子得到功能化的金纳米探针,利用探针对靶标的特异性识别作用,及由此引发的RRS光谱信号变化,实现对ESCC肿瘤标志物和肿瘤细胞的定量检测。具体研究内容和结果如下:1.在半胱胺(Cysteamine,简称Cys)存在下用硼氢化钠还原氯金酸得到Cys稳定的金纳米粒子(Cys-AuNPs)。EGFR抗体(西妥昔单克隆抗体,C225)通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)介导的酰胺化反应共价连接到Cys-AuNPs表面,得到抗体功能化的C225-AuNPs探针。RRS测定时,将探针与EGFR蛋白在适宜条件下混合,由于C225可与EGFR发生特异性结合,因此探针与EGFR发生聚集并引起RRS信号增强。在优化的反应条件下,EGFR浓度与RRS强度呈正比例关系,线性范围30.0-130.0 ng·mL~(-1),检出限4.0 ng·mL~(-1)。试验结果表明所构建的C225-AuNPs探针具有优异的选择性和抗干扰性。将方法应于人血清和食管癌细胞裂解液样品中EGFR的测定,结果令人满意。2.用柠檬酸钠还原氯金酸得到金纳米粒子(AuNPs),巯基修饰的EGFR核酸适配体(Apt)通过Au-S键共价连接到AuNPs表面得到适配体功能化的Apt-AuNPs探针。由于Apt可以靶向识别EGFR,因此Apt-AuNPs探针与靶蛋白发生结合并导致RRS信号的显著增强。在30.0-110.0 ng·mL~(-1)范围内,EGFR浓度与散射增强(ΔI)呈线性关系,检测限为0.7 ng·mL~(-1)。所建立的方法被成功应用于ESCC细胞裂解物和人血清样品中EGFR含量的检测,并对方法的选择性和RRS增强的机理进行了探讨。3.将EGFR抗体(Ab)和EGFR核酸适配体(Apt)同时修饰到AuNPs表面得到复合功能化的Apt-AuNPs-Ab探针。该探针对EGFR具有Ab和Apt的双重靶向作用,可以与EGFR高特异性结合并生成大体积的散射粒子,在312nm处出现特征RRS散射峰,并伴随RRS信号的显著增强。该法检测EGFR的线性范围为20.0-100.0 ng·mL~(-1),检测限低至0.1 ng·mL~(-1),表明复合功能化探针较单一功能化的金纳米探针具有更高的选择性和灵敏度,更适合于低浓度EGFR的RRS检测。方法被成功应用于ESCC细胞裂解物及人血清样品的检测。4.以ESCC细胞Eca109为模型,用复合功能化的Apt-AuNPs-Ab探针与细胞结合并进行RRS测定。结果表明探针对细胞表面过度表达的EGFR蛋白具有高度的特异性,从而很容易地与细胞发生结合。探针与细胞的结合体系具有很好的RRS光谱特性,细胞浓度与RRS信号强度正相关,对Eca109细胞的检测线性范围在1.0×10~2-5.0×10~5 cell·mL~(-1)之间,检测限可达20 cell·mL~(-1)。该方法被成功应用于人血清样品中Eca109细胞的检测,在食管癌早期低浓度癌细胞检测方面具有一定的应用价值。5.以食管癌肿瘤标志物EGFR和HER2为靶标,用EGFR核酸适配体(Apt 1)和HER2适配体(Apt 2)分别修饰AuNPs得到探针Apt 1-AuNPs(Probe I)和Apt 2-AuNPs(Probe II)。用三种不同类型的ESCC细胞:Eca109(EGFR(+))、KYSE510(HER2(+))和KYSE150(EGFR(+)且HER2(+))分别与探针作用,结果表明Probe I+Probe II混合探针可以实现对上述三种细胞的RRS定量检测,检测限分别为15 cell·mL~(-1)(Eca109)、18cell·mL~(-1)(KYSE510)和12 cell·mL~(-1)(KYSE150)。据此提出了一种新的低浓度食管癌细胞的RRS定量分析策略。
【学位授予单位】:太原理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R735.1;O657.3

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