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奶牛乳腺差异表达长链非编码RNA的筛选、鉴定及其功能研究

 
【摘要】:乳腺是乳汁合成与分泌的重要器官。乳腺的发育周期包括妊娠期、泌乳期和退化期,受到生长因子、激素、编码基因和非编码RNA等诸多因素调控。近年来,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)作为一种新的调控分子进入人们的视野,并成为生命科学领域的研究热点之一。研究表明lnc RNA参与诸多生物过程,例如细胞凋亡、增殖和分化,人与小鼠的乳腺发育与泌乳等。然而,lnc RNA在奶牛乳腺中的作用尚不清楚。本研究以干奶期与泌乳期第180 d中国荷斯坦奶牛乳腺为研究对象,采用Illumina Hiseq3000测序平台进行转录组测序,按照差异表达倍数和P0.05分别筛选了差异表达lnc RNA和基因,结合lnc RNA在牛基因组上的位置及与mi R-221潜在互作的筛选标准,对4个lnc RNA进行了后续的功能研究,获得了以下研究结果:1.干奶期与泌乳期奶牛乳腺差异表达lnc RNA和基因的筛选和鉴定(1)分别在干奶期与泌乳期奶牛乳腺中获得了58,411,766和69,114,038个原始数据,其中包含54,805,136和65,069,892个clean reads,clean reads的百分率分别为93.83%和94.15%。另外,在干奶期与泌乳期奶牛乳腺还发现928和841个未注释的转录本,64,316和61,791个已知转录本,其中m RNA分别为44,651和43,094个。(2)干奶期与泌乳期奶牛乳腺中差异表达基因的总数为2,890个,其中,泌乳期显著上调、下调的基因分别为590个和2,300个;GO富集分析表明:显著上调的基因富集于69个生物过程,包括细胞生长负向调控、生长因子活性及钠离子通道复合物等;显著下调的基因富集于45个生物过程,主要包括细胞分化、细胞粘附及细胞表面受体等。另外KEGG分析表明:泌乳期奶牛乳腺显著上调和下调的基因主要富集于PPAR、PI3K-Akt和TNF等信号通路。(3)干奶期与泌乳期奶牛乳腺共发现3,746个差异表达lnc RNA,其中泌乳期显著上调和下调的lnc RNA分别为1,014和2,732个。结合差异表达lnc RNA在牛的基因组位置,分别对145个差异表达lnc RNA的顺式和反式靶基因进行了预测:47个顺式靶基因的GO分析表明,它们主要富集于JAK-STAT负向调控、细胞因子介导的信号通路及磷酸化的正向调节(P0.05);459个反式靶基因的GO分析表明,它们主要参与生长因子连接、蛋白质磷酸化及细胞分化正向调控等过程。另外,KEGG分析发现,145个差异表达lnc RNA的潜在顺式和反式靶基因主要富集于15个信号通路,包括NF-kappa B、MAPK、PI3K-Akt及催乳素等信号通路。2.差异表达lnc RNA的功能研究由于mi R-221能够调控奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)增殖,且4个差异表达lnc RNA(TCONS_00000352、TCONS_00040268TCONS_00087966和TCONS_00015196)与mi R-221存在潜在互作,因此为了进一步研究lnc RNA的功能,分别在BMECs中转染了相关lnc RNA的si RNA及其对照。MTT结果表明,转染24 h后,与对照组相比,干扰TCONS_00000352和TCONS_00040268极显著促进BMECs的活力(P0.01),而干扰TCONS_00015196和TCONS_00087966后极显著抑制BMECs的活力(P0.01);但是转染48 h后,4个lnc RNAs si RNA组的BMECs活力均与对照组无显著差异(P0.05);Ed U结果进一步证明干扰TCONS_00040268和TCONS_00000352后显著促进BMECs的增殖能力(P0.05),而干扰TCONS_00015196和TCONS_00087966后显著抑制BMECs的增殖能力(P0.05)。进一步利用q RT-PCR检测干扰相关lnc RNA后BMECs中与细胞增殖相关基因的表达情况,结果表明:与对照组相比,干扰TCONS_00000352后CDKN1A和CDKN1B基因的相对表达量极显著降低(P0.01),CCND1基因的相对表达量极显著升高(P0.01);干扰TCONS_00040268后CDKN1A基因的相对表达量极显著降低(P0.01),CCND1基因的相对表达量显著升高(P0.05)。干扰TCONS_00015196和TCONS_00087966后,CCND1和CDK2基因的相对表达量极显著降低(P0.01);干扰TCONS_00015196后CDKN1A基因的相对表达量显著升高(P0.05),而干扰TCONS_00087966后CCNE1基因的相对表达量显著降低(P0.05)。3.lnc RNA和mi R-221的互作研究对与奶牛乳腺发育和泌乳相关的mi RNA可能存在互作的差异表达lnc RNA进行预测分析,发现lnc RNA TCONS_00087966和TCONS_00015196可能调控mi R-221而参与泌乳过程,因此利用双荧光素酶报告系统检测了过表达或干扰mi R-221对荧光素酶活性的影响。结果表明,过表达mi R-221极显著降低TCONS_00087966靶序列载体的荧光素酶活性(P0.01),但是干扰表达mi R-221对TCONS_00087966靶序列载体的荧光素酶活性无显著影响(P0.05);过表达mi R-221极显著降低TCONS_00015196靶序列载体的荧光素酶活性(P0.01),而干扰表达mi R-221极显著提高TCONS_00015196靶序列载体的荧光素酶活性(P0.01)。综上所述,本研究对干奶期与泌乳期奶牛乳腺差异表达lnc RNA和基因进行了筛选和鉴定,并对与乳腺增殖相关的mi R-221互作的lnc RNA的功能进行了研究。该研究为丰富奶牛乳腺发育与泌乳的调控机制及奶牛的分子育种工作提供了理论基础。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S823

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